Luc Montagnier kísérlete
Bakteriális DNS szekvenciákból származó vizes nanostruktúrák által létrehozott elektromágneses jelek
Absztrakt: A DNS egy új sajátságának leírása: bizonyos bakteriális DNS szekvenciák nagy hígítású vizes oldatokban elektromágneses hullámokat képesek létrehozni. Úgy tűnik, hogy ez egy olyan rezonancia jelenség, amelyet nagyon kis frekvenciájú környezeti elektromágneses háttérsugárzás vált ki. A legtöbb patogén baktérium genomiális DNS-e tartalmaz olyan szekvenciákat, amelyek képesek ilyen jeleket létrehozni. Ez utat nyit humán és állati betegségekben krónikus bakteriális fertőzések kimutatására szolgáló nagy érzékenységű rendszerek fejlesztéséhez.
A patogén mikroorganizmusok napjainkban nem csupán a gazdaszervezet immunvédekezéséből eredő nagy és szelektív nyomásának vannak kitéve, hanem a nagyon aktív antivirális és antibiotikumos kezeléseket is túl kell élniük. Nem meglepő, hogy számos utat fejlesztettek ki arra, hogy megmeneküljenek ezekből a kedvezőtlen helyzetekből: úgymint rezisztencia mutációk, a felszíni antigének hypervariabilitása, védő biofilmek, a szöveten és a sejten belüli latencia.
Kezdetben azt vettük észre (Montagnier és Lavallee személyes közlés), hogy bizonyos filtrációs eljárások, amelyek a biológiai folyadékok sterilizálását célozták, jól definiált körülmények között olyan fertőző mikroorganizmusokat eredményezhetnek, amelyek a szűrési folyamat előtt jelen voltak. Mycoplasma pirum-mal fertőzött humán limphocyta kultúra felülúszó folyadékának szűrésekor, a körülbelül 300 nM méretű mikroorganizmus a 100 nM vagy 20 nM pórusátmérőjű szűrőn átszűrve, nyilvánvalóan steril folyadékot eredményezett. Ez a folyadék ugyanakkor 2-3 héten belül, amikor a mycoplasma negatív humán lymphocyta kultúrával inkubálták, képes volt regenerálni az eredeti mycoplasmát.
Hasonlóan, a 20 nM-es filtráció a legkisebb fertőző frakcióját sem tartotta meg a HIV-nek, az AIDS okozójának, amely vírusdarab átmérője átlagosan 100-120 nM.
Az ilyen tipusú szűrésének alávetett fertőző formák természetét vizsgálva a szűrlet egy másik sajátságát találtuk, amely esetleg kapcsolódhat vagy független az előzőtől: megfelelő vizes hígítást követően, bizonyos kis frekvenciás elektromágneses hullámokat képesek létrehozni reprodukálhatóan. Az ilyen hullámok kibocsátása valószínűleg rezonancia jelenségre utal, amely a környezeti elektromágneses zajjal történő gerjesztéstől függ. Ez a jelenség adott méretű polimer nanostruktúrák vizes oldatokban való jelenlétével hozható kapcsolatba. A nem fertőzött eukaryóta sejtek felülúszó folyadéka (médiuma), mint kontroll nem mutatja ezt a sajátságot.
Ebben a közleményben elsőként karakterizáljuk az elektromágneses szignálokat (EMS) és az ezeket keltő nanostruktúrákat, amelyeket bizonyos tisztított baktériumok hoznak létre.
Az analízisekhez a M. pirumon felül egy sokkal könzönségesebb baktériumot az E. Coli-t is használtuk. A HIV vírus által létrehozott nanostruktúrák egy másik közleményben lesznek tárgyalva.
Az M. pirum egy kis körte alakú baktérium sejt, ami hasonló a M. Pneumone-hoz, ami növeszthető szintetikus dúsított közegben (SP4) de szintén szaporodik humán T limphocyták felszínén is. A baktériumtörzs, amelyet a kísérleteinkben használtunk egy egészséges személy véréből származó limphocytákból volt izolálva. Az erős, limphocytákhoz való micoplasma kötést egy specifikus molekula az adhesin hozza létre. Az adhesin génjét korábban a szerzők klónozták és szekvenálták.
A micoplasma elsődleges forrása fertőzött humán T limphocyta kultúra felülúszó folyadéka vagy CEM tumorsejtvonal volt. Mielőtt a kísérlteket elkezdtük, minden sejtkultúrának ellenőriztük az M. pirum szennyezettségét polimeráz láncreakcóval (PCR) és nested PCR-ral. A fertőző M. pirum 106-107 egység/ml 5-6 nap alatt volt elérhető mindkét kultúra szándékos megfertőzését követően.
A tisztított felülúszó folyadék szűrése először egy 45 mikroM (450 nM) ?es Millipore filteren történt a törmelékek eltávolítására, azután 0.1 mikroM (100 nM)-es Millipore szűrőkön, vagy 0.02 mikroM (20 nM)-es Whatman szűrőkön. Ténylegesen, a két 100 nM ?es és a 20 nM-es szűrlet bizonyítottan steril volt, amikor az aliquot-ok SP4 médiumban voltak néhány hétig inkubálva. A mycoplazma DNS nyomainak ismételt keresése PCR-ral és nested PCR-ral az adhesin génre vagy a 16S ribosomalis génre specifius primereket használva, konzisztensen negatív eredményt adott.
Ugyanakkor amikor a szűrleteket humán aktivált T limphocytákkal inkubáltuk 2 hétig (100 nM-es) vagy 3 hétig (20 nM-es), a mycoplasma (feléledt) megjelent a mediumban, az összes eredeti sajátságával együtt, amit korábban észleltünk.
Közvetlenül a szűrést követően ugyanezeknek a szűrleteknek a kis frekvenciás elektromágneses hullámkeltését analizáltuk. Erre a célra egy olyan mérőberendezést használtunk, amelyet Benveniste és Call (1996, 2003) tervezett korábban biológiai aktivitással rendelkező izolált molekulák által keltett jelek detektálására. Az összállítás alapelvét az 1. ábra mutatja.
1. ábra.
Az elektromágnenes jelek (EMS) felfogására és analizálására szolgáló berendezés: (1) Tekercs: rézvezeték orsó, impedancia 300 Ohm, (2) Lezárt műanyagcső, amely amely az analizálandó oldat 1 mL-ét tartalmazza. (3) Erősítő, (4) Számítógép szoftverekkel.
Röviden, A 100 nM-es vagy a 20 nM-es szűrletekből 1 a 10-es hígítási sort készítünk. (0.1+0.9 orvosi tisztaságú steril vízben ). Az első két hígítás (1/10 és 1/100) szérum mentes RPMI médiumban történik azért, hogy elkerüljük a fehérjék deionizált vízben történő esetleges kicsapódását. Minden egyes hígítás 1,5 mL-es szorosan lezárt műanyag Eppendorf csőben történik, amit 15 mp-ig erősen összekeverünk Vortex készülékkel (Vortex ráz és kever). Ez a lépés kritikusnak mutatkozott a jelek létrejöttét illetően.
Miután minden hígítás elkészült (általában 15-20 decimális hígítás) a lezárt csöveket egyesével leolvassuk az elektromágneses tekercsben, ami egy 12 V-os teleppel táplált laptop-hoz kacsolt hangkártyához csatlakozik. Minden egyes emissziót (kibocsátott sugárzást) kétszer rögzítettünk 6 mp-ig, 500 szoros erősítéssel, és különböző szoftverek segítségével tettük láthatóvá a jeleket a számítógép monitorán.
Az összetett szignálok felharmónikusainak analizálására több Furier transzformációs programot használtunk. Minden egyes kísérletben először a belső zaj volt rögzítve, amit a leolvasó rendszer különböző darabjai keltenek (a terkercs magában, a tekercs vízzel töltött csővel). A Furier analízis azt mutatta, hogy a zaj főként nagyon kis frekvenciákból tevődik össze , amely legalábbis részben az 50/ 60 Hz-es környező elektromos áramokból származik. A számítógépet ellátó 12 V-os telep használata csökkentette, de nem tüntette el a zajt, amelyet úgy találtunk, hogy szükséges a specifikus nanaostruktúráktól származó rezonanciajelek keltéséhez.
Amikor az. M. pirum szűrlet hígításainak kibocsátott hullámait (emisszió) rögzítettük az első szembetűnő jelenség, amit észleltünk az volt, hogy bizonyos hígításokban a jelek teljes amplitúdója a háttérzaj fölé emelkedett és a frekvencia is megnőtt. Ez a változás megszűnt ha a vizsgált csövet egy olyan dobozba tettük ami réz vagy mű-metál lemezzel volt védve (David 1998).
Az M. pirum jelek Furier analízise magasabb frekvenciák felé tolódást mutatott, közel az 1000 Hz-hez és többszöröseihez. A profilok azonosak voltak az összes hígításban amplitúdó növekedést mutatva (2c and 2d).
Az első alacsony hígítás rendszerint negatív volt, csak háttérzajt mutatott. Pozitív szignálokat 10-5-10-8 vagy 10-12 tartományokban lehetett kapni. Nagyobb hígítások szintén negatívak voltak (3. ábra).
A pozitív hígítások változtak a filtráció típusának megfelelően. A 20 nM-es szűrlet általában magasabb hígításokban lett pozitív, mint a 100 nM-es szűrletek.
Az eredeti szűretlen szuszpenziók negatívak voltak minden hígításban. A jelenség az összes vizsgált mikroorganizmus esetén megfigyelhető volt.
A szignálokat vizes oldatokban létrehozó struktúrák mérete és sűrűsége
A 20 nM-es szűrlet aliquotját (egy adagját) 5-20% (w/v) szaharóz gradiens (vízben oldott) tetejére helyeztük és 35 000 (fordulat per perc) fordulatszámmal 2 órát centrifugáltuk lengőkaros rotorral. Korábban ezeket a paramétereket használtuk az intakt mycoplasna sejtek sűrűség egyensúlyának meghatározására, ami éles határt mutatott az 1,21-es sűrűségnél. A csövek aljáról gyűjtött frakciókat kettesével összeraktuk és a jelkibocsátásukat vizsgáltuk.
A 4. ábra azt mutatja, hogy a jeleket kibocsátó struktúrák a sűrűségtartomány széles sávjában oszlottak el 1.15-1.25 és nagy ülepedési együtthatóval rendelkeztek.
2. ábra
A Mycoplasma pirum szuszpenzióból származó EMS-ek detektálása: Balra: háttér zaj ( egy szűretlen szuszpenzióból vagy egy negatív alacsony hígításból) Jobb: pozitív szignálok (nagy hígításból D7 (10-7). (a): aktuális mérés 2 mp egy 6 mp-es mérésből WaveLab (Steinberg) kezelés után. (b) a jelek részletes analízise (milisecundumos egységekben) (c) Matlab Furier transzformációs analízisek (abcissza 0-20 kHz, ordinata relatív intenzitás, 3D dimenzió: mérések különböző időben). A frekvenciák különböző színekben láthatók (d) Sigview Fourier transzformáció: jegyezzük meg, hogy az új harmónikusok 1000-3000 Hz tartományban vannak.
3. ábra
Az M Pirum vizes hígításából származó jelek egy tipikus rekordja (Matlab software): jegyezzük meg, hogy a pozitív jelek D7-D12 hígításokban vannak.
4. ábra
A Mycoplasma pirum 0,02 mikronos szűrletének cukor sűrűség centrifugálása (35 000 rpm, 2 hr). Az összegyűjtött frakciókat kettesével összeraktuk és D-15-ig hígítottuk majd teszteltük az EMS kibocsátó képességüket. A barok az EMS-re pozitív frakciókat mutatják.
Aztán egy klasszikusabb baktérium az E. coli felé fordultunk a laboratóriumi K1-es törzset használva. Az E coli agitált (oxigenizált) körülmények között, spectrométerrel mérve 109 bakteriális egység/mL-t mutatott. A szuszpenziót azután 10 000-es fordutatszámmal 15 percig centrifugáltuk és a felülúszó folyadékot 450 nM-es filteren szűrtük és a filtrátumot ismét átszűrtük egy 100 nM-es szűrőn. A végső szűrletet sterilnek találtuk amikor tápoldattal ellátott agar mediumra helyeztük, és a kibocsátott elektromágneses hullámokat analizáltuk, ahogyan az M. pirum esetén. A szignálokat előállító hígítások 10-8-10-12 tartományba estek olyan Furier transzformáción alapuló profilokkal, mint az M. pirum esetén. (5. ábra). Egy kísérletben néhány nagyon nagy hígítás is pozitívnak mutatkozott a 10-9-10-18 tartományban. A szűretlen felülúszó folyadék egy aliquot-ja (adagja) nem mutatott semmilyen jelet egészen a 10-38 hígításig ismét mutatva a szűrési lépés kritikus jelentőségét a specifikus jelek létrehozásában.
A M. Pirum-tól való egyetlen eltérés az volt, hogy szignál nem jelentkezett 20 nM-es szűrés után sugallva, hogy a szignálokhoz kapcsolódó struktúramérete nagyobb mint 20 nM és kisebb, mint 100 nM.
Aztán arra a kérdésre kerestük a választ, hogy vajon a kisebb hígítások, amelyeknek logikusan nagyobb számú szignált keltő struktúrát kellene tartalmazni miért némák? Amikor 0,1 mL alacsony hígítású negatív oldatot (pl 10-3) 0.4 mL vagy 0.9 mL pozitív (10-8) oldathoz adtuk, akkor ez utóbbi negatívvá vált. Ez arra utal, hogy az alacsony ?néma? hígítások ön-gátlók, feltehetően a rádiózavarokhoz hasonlóan, az ugyanazokat vagy csak a fázistól alig eltérő hullámhosszakat emittáló többszörös források interferenciájának következtében,. Vagy esetleg a nagy számú nanostruktúrák gélt hoznak létre a vízben, aminek következtében rezgések nem tudnak létrejönni.
5. ábra
Az E. Coli 0,1 mikronos szűrletéből származó EMS. EMS pozitív hígítások D8-D11. (a) Aktuális mérés (b) millisecundum analízis) (c) Fourier transzformációs analízis Matlab. (b) Fourier transzformációs analízis SigView, NF: nem szűrt
Az oldatok közötti ?homológ cross-talk? bizonyítéka
Azután arra voltunk kíváncsiak, hogy lehetséges vagy sem új szignálokat kibocsátó struktúrák létrehozása hullámtranszferek használatával.
6. ábra
A ( E. Coli 0.1 mikronos szűrletéből származó) hígítások közötti ?átbeszélés?. Magyarázatok a szövegben
Jónéhányszor megismételve a következő kísérletet csakugyan ez adódott.
Egy alacsony hígítású (10-3) ?néma? E. coli baktérium- oldatot tartalmazó donor csövet szorosan egy ?hangos? nagy hígítású (10-9) ugyanolyan oldatot tartalmazó ?vevő?cső mellé raktunk. A két cső egy műmetál dobozba volt elhelyezve szobahőmérsékleten 24 órán át. Ezáltal a két cső nem volt kitéve külső elektromágneses zajok hatásának, csak azoknak a jeleknek, amelyeket a csövekben jelenlévő struktúrák keltettek.
A csöveket aztán újra leolvastuk a jeleket felfogó berendezéssel. : a donor cső néma maradt, ugyanakkor a fogadó cső szintén néma lett.
Ráadásul amikor a fogadó cső oldatát tovább hígítottuk (10-10,10-11, 10-12) ezek az oldatok pozitívakká váltak. (6. ábra). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy túl sok új nanostruktúra létrejötte a fogadó csövet elnémította, ami további hígítás után újra jeleket tudott kelteni.
Ez a hatás megszűnt, ha a két cső közé műmetál lemezt helyeztünk a 24 órás együttlét alatt, ami a kisfrekvenciás hullámok szerepét mutatta a jelenség kialakulásában.
Hasonló elektromágneses jelek kibocsátása volt megfigyelhető néhány más baktériumtözs esetén is, úgymint: Steptococcus B, Staphylococcus aurens, Pseudomonas aeroginosa, Proteus mirabilis, Bacillus subtilis, Salmonella, Clostridium perfringens, ugyanabban a hígítási tartományban, mint az E. coli és csak a 100 nM-es szűrést követően (a 20 nM-est követően nem).
Fontos megjegyezni, hogy a két cső közötti transzfer hatás -egy néma és egy hangos között ?csak akkor volt észlelhető, ha a mindkettő ugyanannak a baktériumtörzsnek a hígítását tartalmazta. Más szóval a Staphylococcus donor cső csak a Staphylococcus hígítást tartalmazó vevő csővel tud beszélgetni de sem a Streptococcussal, sem az E. Coli-val nem tud és fordítva.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a transzferhatást faj-specifikus jelek hozzák létre, de ezek frekvenciáit még analizálni kell.
Végezetül két másik kérdést vizsgáltunk az E. Coli rendszerben: az első a kezdeti baktérium sejtszám szerepe a szűrhető szignált létrehozó struktúrák létrehozásában. Az állandó E. Coli. Tenyészetet leszámoltuk és felszaporítottuk 109 sejt/mL-re és 100 as léptékű(?) hígítási sorban elmentünk az 1 sejt/mL hígításig. Minden egyes hígítást 100 nM-es szűrőn átszűrtünk és a jelkibocsátását mértük. Meglepően, a pozitív hígítások tartománya nem függött szigorúan az E. Coli sejtek kezdeti koncentrációjától, nagyjából ugyanaz volt 109 sejjtől lefelé 10 sejtig azt sugallva, hogy ugyanazt a végső nanostruktúra számot értük el minden koncentrációban.Tehát paradox módon 10 sejt ugyanazt a szignált adta, mint 109.
A leolvasást végző személy lehetséges hatása a leolvasásra szintén érdekelt bennünket.
Ennek a kérdésnek a vizsgálatára két egészséges személyt arra kértünk, hogy egymástól függetlenül mérjék meg ugyanazokat az E. Coli hígításokat, úgy hogy egyik sem tudhatja a másik eredményeit. Az eredményeik teljesen azonosak voltak.
Továbbá az eredmények függetlenek voltak attól is, hogy melyik minta volt leolvasva, hogy leszálló sorban a legalacsonyabb hígítástól haladtunk a legmagasabb felé, vagy felszálló sorban a legmagasabbtól a legalacsonyabb felé.
Végül a laboratórium egyik munkatársa az oldott mintákat véletlenszerűen rakta sorba és a leolvasást végzők a jelöléseket nem ismerték. Ugyanazok a pozitív hígítási tartományok mutatkoztak, miközben minden cső jól el volt különítve a többitől, hogy az oldatok komunikációját (cross-talk-ot) elkerüljük.
Azt is találtuk, hogy az eredmények még a lelvasás helyétől is függetlenek: Ugyanabból a szűretlen E Coli tenyészetből kiindulva a szűrlet pozitív hígításai ugyanazok voltak különböző helyeken Franciaországban (Párizs központjában és külvárosában), Kanadában (Montrealban) és Kamerunban (Yaoundeban). Amint az ábra mutatja a háttérzaj különböző volt a mérés helyétől és idejétől függően. Általában nagyobb volt nagy városokban mint elkülönült helyeken. Ugyanakkor a pozitív jelek mindig tisztán elkülönültek a háttértől a nagyobb frekvencia csúcsok által.
A vizes nanaostruktúrák természete
RNAseA (Promega, 1 ?g/ml, 37 C, 1h), Dnase I (Invitrogen, 10 U/?g DNA, 37C, 18h), Lysozyme (Fisher, 1 mg/mL 37C 10 min), Proteinase K (Promega, 0.12 mg/mL in 1% nátrium dodecyl szulfát, 56C 1 h) ?al történő kezelés nem csökkentette az EMS ?t létrehozó aktivitását a hangos hígításoknak és nem aktiválta a néma hígításokat.
Ugyanakkor a 70 C ?os melegítés 30 percen át visszafordíthatatlanul lecsökkentette az aktivitást, ugyanúgy,mint a fagyasztás 1 órán át -20 vagy -60 C. DMSO-nak (10%) és formamidnak (10%) nem volt hatása.
Lítium kationnal való kezelés, amely a vízmolekulák hydrogén kötését befolyásolja képes volt lecsökkenteni a szignálok intenzitását, de a pozitív hígítéások tartománya nem változott.
A bakteriális molekulák természete, amelyekből a nanostruktúrák származnak
Előkísérleteink során azt vettük észre, hogy az E. Coli szuszpenzió 1%-os formaldehiddel történő előkezelését követően sem változik meg a szűrlet elektromágnenses jelkibocsátó képessége, holott a baktériumokat a kezelés elpusztítja. Ez a kezelés megváltoztatja baktérium sejtek felszíni fehérjéit anélkül, hogy érintené a genetikai állományukat, pl a kettős szálú DNS-t. Ez azt sugallta, hogy a szignálok forrása maga a DNS lehet.
Csakugyan, a bakteriális szuszpenzióból klasszikus fenollal (chloroform technika) kivont DNS megfelelő szűrés és vízben történő oldás után képes volt hasonló EMS kibocsátására, mint az ép baktérium ugyanezen körülmények között. A kivont DNS DNAzzal történő kezelése megszüntette az oldat jelkibocsátó képességét olyan körülmények között amikor a DNS által létrehozott nanostruktúrákat lettek tönkretéve.
Az E. Coli DNS-t Proteináz K-val kezeltük SDS (nátrium dodecyl szulfát) jelenlétében és további fehérjementesítést végeztünk fenol-kloroform keverékével. Az ethanollal történő kicsapást követően létrejövő granulátumot újra szuszpendáltuk TRIS-ben (10-2M, pH 7.6) és az aliquotokat (kis adagokat) 1/100 ban oldottuk vízben.. Az oldatot először 450 nM-es szűrőn leszűrtük, majd a filtrátumot ismét átszűrtük egy 100 nM-es szűrőn. A szűrletet tovább hígítottuk vízben, decimális sorozat hígításban, ahogyan ezt korábban leírtuk.
Ahogyan az ép mikroorganizmus esetén, a DNS hígításokban is a szűrési lépés alapvetően fontosnak mutatkozott az EMS detektálás szempontjából. Ennek hiányában semmilyen jelet nem lehetett észlelni, semmilyen hígításban.
Szemben a mikroorganizmus szuszpenzióval, ahol a szűrés feladata az ép sejtek visszatartása, a 100 nM-es szűrés nem tartja vissza a DNS-t, ami optikai denzitásméréssel kimutathatóan, még mindig jelen van a szűrletben. Ugyanakkor a 20 nM-es Whatman szűrővel történő szűrés visszatartja az EMS-t kibocsátó nanostruktúrákat sugallva, hogy a méretük ugyanabban a tartományban van mint azoké, amelyek az ép baktériumokból származnak.
A DNS esetében, a 100 nM-es szűrés szerepe feltehetően a vízben nagy koncentrációban jelen levő gél-szerű folyadékkristályba rendezett nanastruktúra hálózat disszociációja, ami lehetővé teszi a nanostruktúrák diszperzióját (szétszóródását) a további hígításokban. Ahogyan a 7. ábra mutatja, az EMS-re pozitív hígítások ugyanabban a tartományban voltak, mint amiket az ép baktériumoknál észleltünk, általában 10-7-10-13.
7. ábra
A DNáz hatása az EMS létrejöttére. A DNáz kezelt E. Coli DNS oldat és a nem kezelt DNS D2-D15-ig hígítva. Az EMS analízise, ahogyan az 5. ábránál leírtuk. A D2 hígítást (EMS negatív) mint kontrollt mutatjuk. D9 EMS pozitív ( D8-D11 tartományban pozitív hígítások) Jegyezzük meg, hogy a jelek eltűnnek a DNáz kezelt DNS-ből.
A 10-13 nagy hígításban, a számítások azt mutatják, hogy nincs 105 molekulatömegű DNS molekulánál nagyobb, ami valószerűtlenné teszi, hogy a DNS maga hozná létre az EMS-kat, inkább a DNS által létrehozott ?self-sustained? nanostruktúrák.
Általában minden bartérium faj esetén, ami pozitívnak mutatkozik EMS-re a DNS preparátum is pozitív. Egy további bizonyíték, hogy a baktérium által kibocsátott EMS a DNS-ből származik az, hogy hogy DNáz kezelés után az EMS eltűnik.
Az inaktiváció ugyanakkor csak akkor volt teljes, amikor az olyan DNS oldatban , ami maga rezisztens volt a DNáz kezelésre, létrejövő nanostruktúrák korábban teljesen meg lettek semmisítve.
Ez a megsemmisítés történhetett a DNS oldat egy órán át tartó -20 fokon való fagyasztásával, vagy 30 percen át 90 oC-.on való melegítésével.
A melegített (egyszálúsított) DNS lassú hűtése a két komplementer DNS szál újrakapcsolódását (reannealing) eredményezte, ami után DNaz1 kezelés történt 10 U/?g végső koncentrációban 18 órán át inkubálva 37 oC -on 5 mM MgCl2 jelenlétében. A kezeletlen DNS egy aliquotját (adagját) mint pozitív kontrollt tartottuk meg. A DNáz kezelt oldat teljesen EMS mentes volt minden hígításban (7. ábra)
Az E. Coli DNS számos helyén hasító restrikciós enzimmel (EcoRV) kezelt DNS oldatnak nem csökkent az EMS kibocsátó képességét azt sugallva, hogy ez a sugárzás inkább rövidebb mint ritka szekvenciákhoz köthető.
A DNS szekvenciák természete amelyekből az EMS származik
EMS kibocsátására képes baktérium fajták és DNs-ük egy nem teljesen kimerítő feltérképezése azt sugallja, hogy az emberi szervezetre ártalmas baktériumok mind ebbe a kategóriába tartoznak.
Ezzel szemben a probiotikus ?jó? baktériumok mint a Lactobacillus és DNS-e negatív EMS kibocsátásra
Az E. Coli esetében azt találtuk, hogy bizonyos törzsek, amik a gén klónozás plazmid hordozói szintén negatívak (8. ábra)
Ez azt sugallja, hogy csak bizonyos DNS szekvenciákból származik EMS.
Minthogy a patogenitás gyakran együtt jár a mikroorganizmus azon képességével, hogy eukaryota sejthez tud kapcsolódni, különösen nyálkahártya sejtekhez, ezért a vizsgálatainak ismét az M. Pirum DNS-ére fókuszáltuk, ahol egyetlen gén (adhesin 126 kDa fehérje) felelős a mycoplasma emberi sejthez való kapcsolódásáért.
8. ábra
Az M. Pirum DNS-ének adhesint kódoló 1,5 kb ?os fragmentuma által létrehozott EMS. A 1,5 kb-os fragmentumot tartalmazó DNS plazmid-ot használtuk az E.Coli vector átalakítására, XL1blue. A teljes DNS-t vontuk ki és hígítottuk EMS vizsgálatra. Bal: Egy negatív (D2) hígítás kontroll háttér zaja. Jobb: A D10-es hígítás pozitív jelei (D9-D12 tartományban). Alul: Jegyezzük meg a az EMS hiányát amit abban a törzsben mértünk, amit csak a plazmiddal alakítottunk át (a DNS fragmentumot nem tartalmazta).
Ezt a gént korábban munkacsoportunk klónozta és szekvenálta. (Tham és mtsai, 1994). A klónozott DNS mint a fehérje N terminusáhozhoz (1.5 Kbp) és C terminusához (5Kbp) tartozó két fragmentum volt jelen két plazmidban.
A két plazmid (pBluescript SK, Stratagene) ami a DNS fragmentumokt tartalmazta egy E. Coli törzsben volt amplifikálva, XL1blue.
Az E. Coli törzs egymagában (plazmiddal és plazmid nélkül), nem bocsátott ki EMS-t semmilyen hígításban.
Ezzel szemben, amikor a törzs olyan plazmiddal volt átalakítva, ami valamelyik adhesin gén fragmentumot tartalmazta, az EMS létrejött (8. ábra).
A két adhesin DNS fragmentumot azután speciális restrikciós enzimmelhasítottuk (N Terminal:1,5 kbp/SpelEcoRI, C Terminal: 6 kbp/HindIII-XbaI) és elektroforézissel izoláltuk 0,8%-os agaróz gélen. Mind a két DNS fragmentum képes volt EMS létrehozására (nem mutatjuk).
Specifikus primereket használva és és PCR-ral amplifikálva a teljes mycoplazma genomiális DNS-éből szintén kinyertük az adhesin DNS egy nagy frakcióját.
Ismét, ez a fragmentum létrehozta az EMS-t, mutatva, hogy az E. Coli-ból származó plazmidból szennyező DNS nem járul hozzá a folyamathoz (nem mutatjuk).
Diszkusszió
A DNS egy új sajátságát fedeztük fel, vagyis, hogy bizonyos szekvenciák képesek elektromágneses hullámok kibocsátására rezonanciában a környező elektromágneses háttérrel történő gerjesztés után.
Az alacsony érzékenységű és specificitású érzékelő és analizáló rendszerünknek köszönhetően a kibocsátott frekvenciák mind hasonlóak és függetlenek a vizsgált baktériumfajoktól.
Ugyanakkor a műanyag csövön keresztül történő információátadásra vonatkozó kísérletünk azt sugallja, hogy az analízis finomításával és a gerjesztő jelek variabilitásának kiküszöbölésével képesek lehetünk specifikus különbségeket tenni az egyes fajok között, még a szekvenciák között is. Hiszen ez a sajátság lehet, hogy általános minden kettős hélixű DNS-re, beleértve az emberi DNS-t.
De a mi mérési körülményeink között úgy tűnik, hogy csak bizonyos bakteriális szekvenciákkhoz kacsolhatók.
Majd elválik, hogy vajon ezek bizonyos, betegségekben érintett génekre korlátozódnak vagy sem.
A máshol közölt kísérletek valóban azt indikálják, hogy ez a detektálás szintén alkalmazható az emberi szervezetre: ugyanazokat az EMS-ket detektáltuk a plazmában és a DNS-ben, amelyet olyan betegek plazmájából vontunk ki, akik Alzheimer kórban, Parkinzon kórban, Sclerosis multiplexben, Rheumatoid arthritisben szenvedtek. Ez azt sugallná, hogy bakteriális fertőzésjelen van ezekben a betegségekben.
Továbbá EMS-ek szintén kimérhetők a vírusok RNS-eiből is, mint a HIV, influenza A, Hepatitis C vírusokból. Ezekben az esetekben az EMS-ek észleléséhez szükséges optimális szűrés 20 nM alatt van?, sugallva, hogy a létrejövő nanostruktúrák kisebbek, mint amelyeket a bakteriális DNS-ek hoznak létre.
HIV vírussal fertőzött betegek esetében, az EMS-eket leginkább azokban lehet detektálni, akik antiretrovirális kezelést kaptak és nagyon alacsony a plazmájuk vírusterheltsége. Ezeknek a bizonyos nanostruktúráknak a folyamatos jelenléte a plazmában hozzájárulhat a virális reservoirhoz, ami megmenekül az antiviralis kezeléstől és feltehetően a vírus genetikai információját hordozza. A nanostruktúrák -amelyek hozzájárulnak az EMS rezonanciához- fizikai természetét még meg kell határozni.
A DNS korai röntgen diffrakciós vizsgálatából tudjuk, hogy a vízmolekulák szorosan kapcsolódnak a kettős spirálhoz és minden kedő tudja a molekuláris biológiában, hogy vizes olddatban a DNS gélt formál kapcsolódva nagyobb számú vízmolekulához.
Továbbá számos fizikai tanulmány leírta hogy a vízmolekulák hosszú hidrogén kötésekkel kapcsolt dipólus polimereket hoznak létre (Ruan és mtsai 2004, Wernet és mtsai 2004).
Ugyanakkor ezek a kapcsolatok nagyon rövid életűnek tűnnek (Cowan és mtsai 2005). Vajon hosszabb ideig maradhatnak fenn az általuk emittált elektromágneses sugárzás által önfenntartóvá válva, ahogy korábban Del Guidice, Preparata és Vitielo (1988) feltételezte?
Vizsgáltuk a bomlásukat, az oldatok EMS-t kibocsátó képességének idejét, miután kivettük őket a háttér által létrehozott gerjesztésből (mumetál dobozokba helyezve őket). Az EMS kibocsátó képességük legalább néhány órán át tartott, de néha akár 48 óráig is fennmaradt mutatva a nanostruktúrák relatív stabilitását.
Az utóbbi alkalmasan specifikus a DNS szekvenciákra hogy bizonyos genetikai információt hordozhassanak?
Ha igen, akkor mi lehet a szerepük a patogenitásban, kiváltképp a krónikus betegségek létrejöttében?
További vizsgálatok, amelyek szoros kollaborációt igényelnek fizikusok és biológusok között, szükségesek ezeknek a problémáknak a megoldásához.
NOBEL ? díjas tudós bizonyítja a homeopátia tudományos alapjait